Tối ưu hóa điều kiện phản ứng để đạt hiệu suất cao của Stevia Rebaudioside D
Chế độ ăn nhiều đường đã dẫn đến sự gia tăng phổ biến của nhiều bệnh mãn tính, bao gồm béo phì, tiểu đường, bệnh tim mạch và tăng huyết áp, đặt ra một mối quan tâm lớn về sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Stevia Rebaudioside D (Reb D), một chất làm ngọt tự nhiên chiết xuất từ thực vật, đã thu hút sự chú ý đáng kể như một chất thay thế đường nhờ hàm lượng không calo, vị ngọt đậm đà và hương vị dễ chịu.
Tuy nhiên, sự hiện diện hạn chế của nó trong stevia rebaudiana Bertoni và những thách thức liên quan đến độ hòa tan thấp và hoạt tính enzym của glycosyltransferase có nguồn gốc thực vật đã cản trở việc ứng dụng thương mại rộng rãi. Để đối phó với những vấn đề này, một loại glycosyltransferase mới gọi là YojK, có nguồn gốc từ Bacillus subtilis 168, đã được phát hiện. Nghiên cứu này giới thiệu một glycosyltransferase vi khuẩn biến đổi gen, YojK-I241T/G327N, đặc trưng bởi độ hòa tan cao và hiệu quả xúc tác, mang lại tiềm năng lớn cho sản xuất Reb D quy mô công nghiệp.
Phát triển một phương pháp hiệu quả cao để sản xuất rebaudioside D sử dụng phản ứng chuỗi của các enzyme YojK-I241T/G327N và AtSuSy.
Để giải quyết vấn đề hòa tan thấp trong glycosyltransferase có nguồn gốc từ thực vật, các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu tiềm năng sử dụng YojK, một O-glycosyltransferase từ Bacillus subtilis 168. YojK được chọn vì hoạt tính glycosyl hóa đã được chứng minh với nhiều chất nền khác nhau, bao gồm cả các phân tử lớn. Sau khi biểu hiện và tinh chế tái tổ hợp thành công, YojK được sử dụng để glycosylate Reb A, dẫn đến sản xuất Stevia Reb D. Phân tích động học enzyme cho thấy YojK có hoạt tính xúc tác thấp hơn đối với Reb D so với các glycosyltransferase khác. Do đó, nghiên cứu đề xuất sự cần thiết của kỹ thuật hướng dẫn cấu trúc để tăng cường hoạt động xúc tác của YojK cho các ứng dụng thực tiễn tiềm năng. (như thể hiện trong Hình 1)

Hình 1
Tối ưu hóa điều kiện phản ứng để đạt được hiệu suất cao của rebaudioside D.
Các điều kiện phản ứng, bao gồm pH, nhiệt độ và nồng độ chất nền, có thể được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất cao của Srevia Reb D. Nghiên cứu sử dụng mô phỏng động lực học phân tử để điều tra cách biến thể YojK-I241T/G327N tăng cường glycosyl hóa Reb D. Biến thể này duy trì liên kết hydro ổn định giữa Reb A và H14 trong quá trình mô phỏng, khác với loại hoang dã (như thể hiện trong Hình 2). Sự ổn định này cũng mở rộng đến khoảng cách giữa nguyên tử O2 của Reb A và C1P của UDPG. Hiệu suất xúc tác cải thiện của biến thể YojK-I241T/G327N được cho là nhờ các tương tác ổn định này, gợi ý tiềm năng thực tiễn của nó.
Hình 2

Hình 3
Kết luận
Phương pháp này cho kết quả 83,47% Reb D. Đáng chú ý, thêm 1 mM UDPG cho phép tổng hợp 20,59 g/L Reb D với hiệu suất đáng kể 91,29%, vượt qua các nghiên cứu trước đó. Quy trình này cho thấy tiềm năng sản xuất Reb D quy mô công nghiệp, đặc biệt sau kỹ thuật kết cấu của YojK.YojK có thể được biểu hiện hiệu quả trong E. coli BL21 (DE3) với độ hòa tan cao. Thông qua kỹ thuật hướng dẫn cấu trúc, một đột biến kép, YojK-I241T/G327N, đã được tạo ra, cho phép sản xuất quy mô lớn Reb D với năng suất vượt trội 91,29% bằng cách tái chế UDPG xúc tác bởi tổng hợp sucrose AtSuSy. Nghiên cứu này trình bày YojK-I241T/G327N như một công cụ đầy hứa hẹn cho sản xuất Reb D quy mô công nghiệp hiệu quả về kinh tế.