优化反应条件以实现甜菊糖苷 D 的高产率
Chế độ ăn nhiều đường đã dẫn đến tỷ lệ mắc các bệnh mãn tính khác nhau ngày càng tăng, bao gồm béo phì, tiểu đường, bệnh tim mạch và tăng huyết áp, gây ra mối quan tâm lớn về sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Stevia Rebaudioside D (Reb D), một chất tạo ngọt tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật, đã thu hút sự chú ý đáng kể như một chất thay thế đường nhờ hàm lượng calo bằng không, độ ngọt cao và hương vị dễ chịu.
Tuy nhiên, sự hiện diện hạn chế của nó trong cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) và những thách thức liên quan đến độ hòa tan thấp và hoạt tính enzyme của glycosyltransferase có nguồn gốc thực vật đã cản trở ứng dụng thương mại rộng rãi của nó. Để giải quyết những vấn đề này, một glycosyltransferase mới có tên YojK, có nguồn gốc từ Bacillus subtilis 168, đã được phát hiện. Nghiên cứu này giới thiệu một glycosyltransferase vi khuẩn biến đổi gen, YojK-I241T/G327N, được đặc trưng bởi độ hòa tan và hiệu suất xúc tác cao, mang lại tiềm năng lớn cho sản xuất công nghiệp Reb D.
Việc phát triển một phương pháp hiệu quả cao để sản xuất rebaudioside D bằng cách sử dụng phản ứng xúc tác nối tiếp của các enzyme YojK-I241T/G327N và AtSuSy.
Để giải quyết vấn đề độ hòa tan thấp trong glycosyltransferase có nguồn gốc thực vật, các nhà nghiên cứu đã điều tra tiềm năng sử dụng YojK, một O-glycosyltransferase từ Bacillus subtilis 168. YojK được chọn vì hoạt tính glycosyl hóa đã được chứng minh của nó với nhiều cơ chất khác nhau, bao gồm cả các phân tử lớn. Sau khi biểu hiện và tinh chế tái tổ hợp thành công, YojK được sử dụng để glycosyl hóa Reb A, dẫn đến việc sản xuất Stevia Reb D. Phân tích động học enzyme cho thấy YojK có hoạt tính xúc tác thấp hơn đối với Reb D so với các glycosyltransferase khác. Do đó, nghiên cứu đề xuất sự cần thiết của việc thiết kế dựa trên cấu trúc để tăng cường hoạt tính xúc tác của YojK cho các ứng dụng thực tế tiềm năng. (như thể hiện trong Hình 1)
Hình 1
Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để đạt được sản lượng cao rebaudioside D.
Các điều kiện phản ứng, bao gồm pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất, có thể được tối ưu hóa để đạt được sản lượng cao Srevia Reb D. Nghiên cứu đã sử dụng mô phỏng động lực phân tử để điều tra cách biến thể YojK-I241T/G327N tăng cường glycosyl hóa Reb D. Biến thể này duy trì liên kết hydro ổn định giữa Reb A và H14 trong các mô phỏng, không giống như loại hoang dại (như thể hiện trong Hình 2). Sự ổn định này cũng mở rộng đến khoảng cách giữa nguyên tử O2 của Reb A và C1P của UDPG. Hiệu quả xúc tác được cải thiện của biến thể YojK-I241T/G327N được cho là nhờ các tương tác ổn định này, cho thấy tiềm năng thực tế của nó.
Hình 2
图3
Kết luận
Phương pháp này đạt được 83,47% Reb D. Đáng chú ý, việc thêm 1 mM UDPG cho phép tổng hợp 20,59 g/L Reb D với sản lượng đáng kể 91,29%, vượt qua các nghiên cứu trước đây. Quy trình này chứng minh tiềm năng sản xuất Reb D ở quy mô công nghiệp, đặc biệt là sau khi thiết kế cấu trúc của YojK.YojK có thể được biểu hiện hiệu quả trong E. coli BL21 (DE3) với độ hòa tan cao. Thông qua thiết kế dựa trên cấu trúc, một đột biến kép, YojK-I241T/G327N, đã được tạo ra, cho phép sản xuất quy mô lớn Reb D với sản lượng đặc biệt 91,29% bằng cách tái chế UDPG được xúc tác bởi sucrose synthase AtSuSy. Nghiên cứu này trình bày YojK-I241T/G327N như một công cụ đầy hứa hẹn để sản xuất Reb D ở quy mô công nghiệp hiệu quả về mặt kinh tế.
