Kỹ thuật enzyme liên kết với tăng trưởng thông qua điều chỉnh tái tạo đồng yếu tố oxy hóa khử
Kỹ thuật enzyme liên kết với tăng trưởng thông qua điều chỉnh tái tạo đồng yếu tố oxy hóa khử
Ngày càng có nhiều loại hóa chất được sản xuất từ nguyên liệu tái tạo thông qua các phương tiện công nghệ sinh học. Các quy trình sinh học phụ thuộc nhiều vào xúc tác enzyme để sản xuất hiệu quả các hợp chất này. Do đó, việc đảm bảo enzyme hoạt động tối ưu trong môi trường cần thiết là mối quan tâm hàng đầu cho sản xuất bền vững.
Các đặc tính như tính đặc hiệu cơ chất, tốc độ xúc tác và độ ổn định (nhiệt) là một trong số các yếu tố quan trọng phải được tối ưu hóa cho các quy trình sinh học hiệu quả dựa trên enzyme. Việc tối ưu hóa này có thể tốn thời gian, tốn kém và đầy thách thức, do đó, các cách hiệu quả và tiết kiệm chi phí có khả năng cho chọn lọc liên kết với tăng trưởng, kỹ thuật enzyme với các đặc tính mong muốn được săn đón rất nhiều.
Ưu điểm của việc sử dụng chọn lọc liên kết với tăng trưởng như một hình thức chọn lọc enzyme, bao gồm việc liên kết hoạt động của enzyme với sự tăng trưởng của tế bào. Phương pháp này có thể được sử dụng như một chiến lược chọn lọc thông lượng cao và có thể đạt được bằng cách đảm bảo sự tăng trưởng phụ thuộc vào quá trình tổng hợp sản phẩm bởi enzyme mục tiêu hoặc bằng cách liên kết hoạt động của enzyme với trạng thái năng lượng toàn cầu của tế bào. Sinh học tổng hợp có thể được sử dụng để kỹ thuật các chủng phù hợp cho chọn lọc liên kết với tăng trưởng, và các tiến bộ gần đây tập trung vào việc kỹ thuật các chủng thiếu hụt trạng thái oxy hóa hoặc khử của các cặp đồng yếu tố oxy hóa khử, có thể đóng vai trò là nền tảng kỹ thuật enzyme. Việc sử dụng các nền tảng này có thể đẩy nhanh sự phát triển của các chất xúc tác sinh học và quy trình sinh học được cải thiện.
Lợi ích của việc ghép tăng trưởng thông qua auxotrophy đồng yếu tố
Lợi ích của việc sử dụng auxotrophy đồng yếu tố như một phương pháp chọn lọc để kỹ thuật các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp một số hóa chất nhất định, chẳng hạn như lipid, nhiên liệu sinh học, khí, dung môi hữu cơ hoặc các hợp chất polymer. Cách tiếp cận này mang lại một số lợi ích độc đáo, bao gồm khả năng chọn lọc sản phẩm mong muốn một cách độc lập với cơ chất hoặc sản phẩm quan tâm, giúp dễ dàng phát hiện hoạt động enzyme được cải thiện và cung cấp tín hiệu đọc để phát hiện hoạt động enzyme được cải thiện. Ngoài ra, việc sử dụng auxotroph đồng yếu tố như nền tảng ghép tăng trưởng có lợi vì bản chất phổ biến của các đồng yếu tố oxy hóa khử trong trao đổi chất của vi sinh vật có nghĩa là các chiến lược kỹ thuật có thể được chuyển giao theo chiều ngang cho các vi sinh vật quan tâm khác và enzyme có thể được kỹ thuật trực tiếp trong môi trường của vật chủ vi sinh vật mong muốn. (được thể hiện trong hình 1)
Hình 1: So sánh một số kỹ thuật sàng lọc/chọn lọc được sử dụng rộng rãi cho kỹ thuật enzyme
Các đột biến thiếu hụt quá trình oxy hóa NADH
Quá trình oxy hóa NADH ở E. coli có thể xảy ra qua hai con đường, tùy thuộc vào sự sẵn có của oxy. Trong điều kiện hiếu khí, NADH chủ yếu được oxy hóa thông qua hô hấp để tạo ATP, trong khi trong điều kiện kỵ khí, nó có thể được oxy hóa thông qua các con đường lên men để tạo ra lactate và ethanol. Các chủng đột biến của E. coli, không thể sử dụng các con đường lên men hỗn hợp để oxy hóa NADH trong quá trình tăng trưởng kỵ khí, đã được sử dụng để thúc đẩy các con đường oxy hóa NADH cho quá trình tổng hợp kỵ khí các hóa chất khác nhau, chẳng hạn như 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol và L-alanine. Các chủng đột biến này cũng đã được sử dụng để kỹ thuật enzyme bằng cách khai thác các nguyên tắc oxy hóa khử tương tự, tạo ra các biến thể được cải thiện. Các chủng thu được có thể được sử dụng để kỹ thuật các enzyme và con đường phụ thuộc NAD(P)H khác.
Các đột biến thiếu hụt quá trình khử NAD+
Wenk và cộng sự đã tạo ra một chủng E. coli bằng cách xóa gen dihydrolipoyl dehydrogenase (lpd), dẫn đến chủng này không thể tạo ra năng lượng khử (NADH và NADPH) từ quá trình trao đổi chất acetate do thiếu hoạt động pyruvate dehydrogenase. Điều này khiến chủng này biểu hiện auxotrophy đối với năng lượng khử khi được nuôi cấy hiếu khí trên acetate như một nguồn carbon duy nhất. (được thể hiện trong hình 2) Chủng này có thể phát triển trên acetate khi được bổ sung các cơ chất đường phân phía trên hoặc khi biểu hiện các dehydrogenase phụ thuộc NAD+ đối với formate, ethanol hoặc methanol với các cơ chất tương ứng của chúng. Chủng này không được sử dụng cho kỹ thuật enzyme và chỉ được đánh giá về auxotrophy đồng yếu tố oxy hóa khử.
Hình 2: Trao đổi chất trung tâm
Các đột biến thiếu hụt quá trình oxy hóa NADPH
Có hai chiến lược khác nhau để tạo ra auxotrophy NADP+ ở E. coli, dựa trên việc kỹ thuật con đường đường phân để sản xuất quá mức NADPH. Chiến lược đầu tiên liên quan đến việc xóa gen gapA bản địa và biểu hiện enzyme GAPDH phụ thuộc NADP+ dị loại, trong khi chiến lược thứ hai liên quan đến việc chuyển hướng dòng carbon qua con đường pentose phosphate. Các chủng thu được không thể phát triển trên glucose nhưng thể hiện sự tăng trưởng trong các điều kiện khác nhau, với chủng đầu tiên được nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí và chủng thứ hai trong điều kiện hiếu khí với glycerol làm cơ chất. Các chủng này được sử dụng để kỹ thuật các enzyme có các đặc tính được cải thiện, bao gồm tính đặc hiệu cơ chất, hoạt động xúc tác và độ ổn định nhiệt.
Các đột biến thiếu hụt quá trình khử NADP+
Ba loại vi khuẩn khác nhau, E. coli, P. putida và C. glutamicum, đã được kỹ thuật để trở thành auxotroph NADPH, nghĩa là chúng cần NADPH ngoại sinh để tăng trưởng. Trong trường hợp của E. coli và C. glutamicum, các enzyme trao đổi chất trung tâm đã bị loại bỏ để tránh quá trình khử NADP+ khi glucose được cung cấp như một nguồn carbon, trong khi ở P. putida, kỹ thuật hỗ trợ CRISPR/nCas9 đã được sử dụng để phá vỡ các bộ gen mục tiêu một cách tuần tự để hiểu sự tham gia của chúng trong trao đổi chất oxy hóa khử. Các chủng auxotroph NADPH sau đó được sử dụng cho kỹ thuật enzyme liên kết với tăng trưởng dựa trên tính đặc hiệu đồng yếu tố. Một vòng đột biến duy nhất sử dụng E. coli đã tạo ra enzyme formate dehydrogenase phụ thuộc NADP+ hiệu quả và đặc hiệu nhất cho đến nay, trong khi P. putida và C. glutamicum đại diện cho các chủng đầu tiên của loài của chúng có thể được sử dụng cho loại kỹ thuật này.
Các đột biến thiếu hụt quá trình khử NMN+
Một hệ thống chọn lọc liên kết tăng trưởng đã được phát triển để liên kết chu trình đồng yếu tố và sự tăng trưởng dựa trên sự thiếu hụt trong quá trình khử NMN+. Chủng E. coli SHuffle đã được sử dụng, mang các đột biến xóa ở hai gen liên quan đến sản xuất glutathione khử. Một glutathione reductase phụ thuộc NMNH đã được phát triển thông qua gây đột biến hợp lý để liên kết quá trình này với chu trình NMN+/NMNH, và một glucose dehydrogenase phụ thuộc NMN+ đã được sử dụng để hỗ trợ chu trình đồng yếu tố NMN+/NMNH và do đó hỗ trợ sự tăng trưởng. Nghiên cứu cũng áp dụng auxotrophy đồng yếu tố oxy hóa khử không kinh điển cho kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng lần đầu tiên, tạo ra một biến thể phosphite dehydrogenase ổn định nhiệt với hiệu quả xúc tác được cải thiện và độ ổn định theo thời gian trong ống nghiệm. Công trình này cung cấp một chủng hữu ích cho kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng, phụ thuộc vào chu trình NMN+/NMNH và auxotrophic đối với trạng thái khử của một đồng yếu tố oxy hóa khử không kinh điển.
Tiềm năng của việc liên kết tăng trưởng thông qua các đồng yếu tố oxy hóa khử đã hoạt động như một công cụ mạnh mẽ để kỹ thuật các chất xúc tác sinh học, đặc biệt trong bối cảnh sản xuất sinh học bền vững. Mặc dù đã đạt được tiến bộ đáng kể trong việc tạo ra các chủng auxotrophic đồng yếu tố oxy hóa khử, tuyên bố này cho thấy vẫn còn một số hướng nghiên cứu chưa được khám phá. Một trong số đó liên quan đến việc kỹ thuật các chủng auxotrophic đồng yếu tố của các sinh vật khác ngoài E. coli, điều này có thể mở ra những khả năng mới cho kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng.
Nhìn chung, điều này cho thấy việc sử dụng liên kết tăng trưởng dựa trên đồng yếu tố oxy hóa khử đại diện cho một cơ hội lớn để kỹ thuật xúc tác sinh học, đặc biệt là để sản xuất các sản phẩm không thể đáp ứng các yêu cầu của các phương pháp kỹ thuật enzyme thông lượng cao khác. Nó nhấn mạnh nhu cầu phát triển các chất xúc tác sinh học linh hoạt và hiệu quả hơn cho sản xuất sinh học bền vững và nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tiếp tục nghiên cứu trong lĩnh vực này.
Tài liệu tham khảo: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng thông qua điều chỉnh tái tạo đồng yếu tố oxy hóa khử, Biotechnology Advances, 2023.
