Kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng thông qua thao tác tái tạo đồng yếu tố oxi hóa khử

Ngày càng có nhiều loại hóa chất được sản xuất từ nguyên liệu tái tạo thông qua các phương pháp công nghệ sinh học. Quá trình sinh học phụ thuộc nhiều vào xúc tác enzym để sản xuất hiệu quả các hợp chất này. Đảm bảo enzyme hoạt động tối ưu trong môi trường yêu cầu là điều rất quan trọng đối với sản xuất bền vững.

Các đặc tính như đặc hiệu chất nền, tốc độ xúc tác và độ ổn định (nhiệt) là một số yếu tố quan trọng cần được tối ưu hóa để có các quá trình sinh học do enzyme điều khiển hiệu quả. Việc tối ưu hóa này có thể tốn nhiều thời gian, tốn kém và thách thức, do đó các phương pháp lựa chọn kết hợp tăng trưởng hiệu quả và tiết kiệm chi phí có thể xảy ra, các enzyme kỹ thuật với đặc tính mong muốn được săn đón.

Ưu điểm của việc sử dụng chọn lọc liên kết tăng trưởng như một hình thức chọn lọc enzyme, bao gồm việc liên kết hoạt động của enzyme với sự phát triển của tế bào. Phương pháp này có thể được sử dụng như một chiến lược chọn lọc với tốc độ cao, và có thể đạt được bằng cách đảm bảo sự tăng trưởng phụ thuộc vào tổng hợp sản phẩm của enzyme mục tiêu hoặc bằng cách liên kết hoạt động của enzyme với trạng thái năng lượng toàn cầu của tế bào. Sinh học tổng hợp có thể được sử dụng để thiết kế các chủng phù hợp cho chọn lọc theo phương pháp tăng trưởng, và các tiến bộ gần đây tập trung vào kỹ thuật các chủng thiếu trạng thái oxy hóa hoặc giảm của các cặp đồng yếu tố oxi hóa, vốn có thể đóng vai trò như nền tảng kỹ thuật enzyme. Việc sử dụng các nền tảng này có thể thúc đẩy phát triển các chất xúc tác sinh học và quy trình sinh học cải tiến.

Lợi ích của sự kết hợp tăng trưởng thông qua đồng yếu tố auxotrophy

Lợi ích của việc sử dụng đồng yếu tố auxotrophy như một phương pháp lựa chọn để thiết kế các enzyme tham gia sinh tổng hợp một số hóa chất nhất định, như lipid, nhiên liệu sinh học, khí, dung môi hữu cơ hoặc hợp chất polymer. Phương pháp này mang lại nhiều lợi ích độc đáo, bao gồm khả năng lựa chọn sản phẩm mong muốn độc lập với chất nền hoặc sản phẩm quan tâm, giúp dễ dàng phát hiện hoạt động enzym được cải thiện, và cung cấp hiển thị để phát hiện hoạt động enzym được cải thiện. Ngoài ra, việc sử dụng các đồng nhân dưỡng làm nền tảng ghép nối tăng trưởng cũng có lợi vì tính phổ biến của các đồng yếu tố oxi hóa khử trong chuyển hóa vi sinh vật cho phép các chiến lược kỹ thuật có thể chuyển giao ngang sang các vi sinh vật khác quan tâm, và enzyme có thể được thiết kế trực tiếp trong môi trường của vật chủ vi sinh vật mong muốn. (thể hiện ở hình 1)

Hình 1: So sánh một số kỹ thuật sàng lọc/chọn lọc được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme

Các đột biến thiếu oxy hóa NADH

Quá trình oxy hóa NADH ở E. coli có thể xảy ra qua hai con đường, tùy thuộc vào lượng oxy sẵn có. Trong điều kiện hiếu khí, NADH chủ yếu bị oxy hóa thông qua hô hấp để tạo ra ATP, trong khi ở điều kiện kỵ khí, nó có thể bị oxy hóa qua các con đường lên men để tạo ra lactate và ethanol. Các chủng đột biến của E. coli, không thể sử dụng các con đường lên men hỗn hợp để oxy hóa NADH trong quá trình tăng trưởng kỵ khí, đã được sử dụng để thúc đẩy các con đường oxy hóa NADH cho quá trình tổng hợp kỵ khí của nhiều hóa chất khác nhau, như 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol và L-alanine. Các chủng đột biến này cũng đã được sử dụng để tạo ra enzyme bằng cách khai thác các nguyên lý oxi hóa khử tương tự, tạo ra các biến thể cải tiến. Các chủng thu được có thể được sử dụng để thiết kế các enzyme và con đường phụ thuộc NAD(P)H khác.

Đột biến thiếu giảm NAD+  

Wenk và cộng sự đã tạo ra một chủng E. coli bằng cách loại bỏ gen dihydrolipoyl dehydrogenase (lpd), khiến chủng này không thể tạo ra năng lượng giảm (NADH và NADPH) từ chuyển hóa acetate do không có hoạt tính pyruvate dehydrogenase. Điều này khiến giống này biểu hiện auxotrophy để giảm công suất khi nuôi cấy hiếu khí trên acetate làm nguồn carbon duy nhất. (thể hiện ở hình 2) Chủng này có thể phát triển trên acetate khi được bổ sung bằng các chất nền glycolytic trên hoặc khi biểu hiện các enzyme dehydrogenase formate, ethanol hoặc methanol phụ thuộc NAD+ cùng với các chất nền tương ứng. Chủng này không được sử dụng cho kỹ thuật enzyme mà chỉ được đánh giá về đồng yếu tố oxi hóa khử (redox auxobrophy).
 

Hình 2: Chuyển hóa trung ương 

Đột biến thiếu oxy hóa NADPH

Có hai chiến lược khác nhau để kích thích auxotrophy NADP+ ở E. coli, dựa vào việc thiết kế con đường phân đường để sản xuất quá nhiều NADPH. Chiến lược đầu tiên là loại bỏ gen gapA gốc và biểu hiện enzyme GAPDH phụ thuộc NADP+ dị thể, trong khi chiến lược thứ hai là chuyển hướng dòng carbon qua con đường pentose phosphate. Các chủng thu được không thể phát triển trên glucose mà thể hiện sự phát triển trong các điều kiện khác nhau, với chủng đầu tiên được trồng trong điều kiện kỵ khí và chủng thứ hai được trồng trong điều kiện hiếu khí với glycerol làm chất nền. Những chủng này được sử dụng để thiết kế các enzyme có đặc tính cải thiện, bao gồm đặc hiệu chất nền, hoạt tính xúc tác và độ bền nhiệt.

Đột biến thiếu giảm NADP+

Ba loại vi khuẩn khác nhau, E. coli, P. putida và C. glutamicum, đã được thiết kế để có NADPH-auxotrophic, nghĩa là chúng cần NADPH ngoại sinh để phát triển. Trong trường hợp của E. coli và C. glutamicum, các enzyme chuyển hóa trung tâm bị loại bỏ để tránh giảm NADP+ khi glucose được cung cấp làm nguồn carbon, trong khi ở P. putida, kỹ thuật hỗ trợ CRISPR/nCas9 được sử dụng để phá vỡ các tập hợp gen mục tiêu theo thứ tự nhằm hiểu vai trò của chúng trong chuyển hóa oxi hóa. Các chủng NADPH-auxotrophic sau đó được sử dụng để kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng dựa trên tính đặc hiệu đồng yếu tố. Một đợt đột biến duy nhất sử dụng E. coli đã tạo ra formate dehydrogenase phụ thuộc NADP+ hiệu quả và đặc hiệu nhất từ trước đến nay, trong khi P. putida và C. glutamicum là những chủng đầu tiên của loài chúng có thể được sử dụng cho loại kỹ thuật này.

Đột biến thiếu giảm NMN+

Một hệ thống chọn lọc liên kết tăng trưởng đã được phát triển để liên kết chu kỳ đồng yếu tố và tăng trưởng dựa trên sự thiếu hụt giảm NMN+. Chủng E. coli SHuffle đã được sử dụng, mang theo sự mất đi của hai gen tham gia sản xuất glutathione giảm. Một loại glutathione reductase phụ thuộc NMNH được phát triển thông qua đột biến hợp lý để liên kết quá trình này với chu kỳ NMN+/NMNH, và một enzyme glucose dehydrogenase phụ thuộc NMN+ được sử dụng để hỗ trợ chu kỳ đồng yếu tố NMN+/NMNH và do đó thúc đẩy sự phát triển. Nghiên cứu cũng lần đầu tiên áp dụng auxotrophy đồng oxi hóa khử không chuẩn tắc cho kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng, tạo ra biến thể phosphite dehydrogenase ổn định nhiệt với hiệu quả xúc tác và ổn định thời gian cải thiện trong ống nghiệm. Công trình này cung cấp một chủng hữu ích cho kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng, phụ thuộc vào chu kỳ NMN+/NMNH và auxotrophic cho trạng thái giảm của một cofactor oxi hóa khử không chuẩn tắc.

Tiềm năng của sự kết hợp tăng trưởng thông qua các đồng yếu tố oxi hóa khử đã hoạt động như một công cụ mạnh mẽ để thiết kế các chất xúc tác sinh học, đặc biệt trong bối cảnh sản xuất sinh học bền vững. Mặc dù đã có tiến bộ đáng kể trong việc tạo ra các chủng đồng oxi hóa khử auxotrophic, tuyên bố cho thấy vẫn còn một số hướng nghiên cứu chưa được khám phá. Một trong số đó là kỹ thuật các chủng đồng yếu tố auxotrophic của các sinh vật khác ngoài E. coli, điều này có thể mở ra những khả năng mới cho kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng.

Tổng thể, nó cho thấy việc sử dụng liên kết tăng trưởng dựa trên đồng oxi hóa khử là một cơ hội lớn cho kỹ thuật xúc tác sinh học, đặc biệt đối với việc sản xuất các sản phẩm không thể đáp ứng yêu cầu của các phương pháp kỹ thuật enzyme thông lượng cao khác. Báo cáo nhấn mạnh sự cần thiết phải phát triển các chất xúc tác sinh học đa năng và hiệu quả hơn cho sản xuất sinh học bền vững, đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tiếp tục nghiên cứu trong lĩnh vực này.


Tham khảo: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Kỹ thuật enzyme liên kết tăng trưởng thông qua thao tác tái sinh đồng yếu tố oxi hóa, Biotechnology Advances, 2023.